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Um microscópio óptico básico. O microscópio óptico ou microscópio fotônico é um instrumento óptico equipado com uma objetiva e uma ocular que permite ampliar a imagem de um pequeno objeto (o que caracteriza seu poder óptico) e separar os detalhes dessa imagem (e seu poder de resolução ) para que possa ser observado pelo olho humano. É usado na biologia , para observar células, tecidos, na petrografia para reconhecer rochas, na metalurgia e na metalografia para examinar a estrutura de um metal ou liga. Não deve ser confundida com a lupa binocular que não requer amostras planas finas, ou reflexivas, e permite observar partes naturais sem preparação ampliando a imagem por um fator baixo, mas mantendo a visão estereoscópica propícia ao exame macroscópico revelando grãos, fissuras, rachaduras, etc. Atualmente, os microscópios ópticos mais poderosos têm uma ampliação de × 2500. Devido às limitações do espectro de luz visível, os microscópios ópticos, com ampliação suficiente, permitem a observação de células (mas não todas as unidades e subunidades celulares), fungos, protozoários, bactérias, mas não permitem a observação de vírus. HistóriaÉ difícil dizer quem inventou o microscópio composto. Diz-se frequentemente que o holandês óptico Hans Janssen e seu filho Zacharias Janssen fabricou o primeiro microscópio em 1595, mas isso vem de uma declaração pelo próprio Zacharias Janssen no meio do XVII th século . Zacharias Janssen nasceu por volta de 1570. Outro favorito como inventor do microscópio é Galileo . Ele desenvolveu um occhiolino , um microscópio feito de uma lente convexa e outra côncava em 1609. Athanasius Kircher descreveu seu microscópio em 1646, que ele usou para a observação de sangue.
Um desenho de Francesco Stelluti de três abelhas aparece no selo do Papa Urbano VIII (1623-1644) e passa pela primeira imagem de microscopia publicada. Christian Huygens , outro holandês, desenvolvido no final do XVII ° século um simples ocular dupla corrigido aberrações cromáticas, que foi um grande passo em frente no desenvolvimento do microscópio. A ocular Huygens ainda é fabricada hoje, mas apresenta um campo de visão bastante pequeno e outros problemas menores. Geralmente atribuída a Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723) não tendo atraído a atenção dos biólogos sobre os usos do microscópio, mesmo se lupas comuns já foram fabricados e utilizados na XVI th século . Os microscópios feitos à mão de Van Leeuwenhoek eram instrumentos simples e de pequena escala que incluíam uma lente única, mas forte. Em comparação, vários sistemas de lentes permaneceram difíceis de desenvolver e levou nada menos que 150 anos de desenvolvimento óptico antes que o microscópio composto pudesse fornecer uma qualidade de imagem equivalente à dos microscópios únicos de Van Leeuwenhoek. No entanto, e apesar de muitas afirmações, não se pode considerar Antoni Van Leeuwenhoek como o inventor do microscópio composto. Robert Hooke também é um dos primeiros a conceber. Primeira abordagemPrincípio do microscópio óptico básicoPrincípio de um microscópio. Animação de como funciona um microscópio. O microscópio óptico é um sistema óptico com lentes cujo objetivo é obter uma imagem ampliada do objeto observado. O objeto a ser observado é colocado em frente ao primeiro grupo óptico denominado " objetivo ". Se o objeto estiver além do comprimento focal, ele forma uma imagem real invertida de um tamanho diferente; a imagem é maior do que o objeto se o objeto estiver localizado a uma distância menor que o dobro do comprimento focal da lente. O segundo grupo óptico do lado do observador é a ocular : ela é posicionada de forma que a imagem esteja em seu plano focal. Assim, o olho observa uma imagem “no infinito” (para um observador padrão), portanto, relaxando os músculos responsáveis pela acomodação , oferecendo melhor conforto visual. Princípio de um microscópio simplificado. É um sistema dióptrico centrado, parcialmente composto de dupletos para corrigir algumas das aberrações ópticas. Ao contrário de outros sistemas óticos que são definidos por sua ampliação ótica ( telescópio ) ou sua ampliação ( câmera ), o termo apropriado, para o microscópio, é sua potência , relação do ângulo sob o qual o objeto é visto. Através do instrumento, para o comprimento desse objeto. A técnica de iluminação mais amplamente usada na microscopia de campo amplo clássica é a iluminação de Köhler , que garante uma qualidade de imagem ideal. Constituição do microscópioDiagrama de um microscópio óptico. De baixo para cima :
A ocular pode ser substituída por uma câmera fotográfica, ou - no caso da videomicroscopia - por uma câmera de vídeo ou uma câmera CCD para fazer uma aquisição digital. Isso permite fazer a observação em um monitor de vídeo (tela do tipo televisão) e facilitar o uso e processamento das imagens (impressão, processamento em computador, telemedicina , etc.). Limitações do microscópio ópticoA resolução de um microscópio se refere à sua capacidade de separar detalhes muito semelhantes. Independentemente do sensor usado e das aberrações ou imperfeições da lente, a resolução do microscópio óptico é fundamentalmente limitada pela difração da luz. De fato, devido à difração, a imagem de um ponto não é um ponto, mas um ponto (o ponto Airy ou mais geralmente a função de espalhamento de ponto - PSF). Assim, dois pontos distintos mas vizinhos terão para as imagens dois pontos cuja sobreposição pode impedir que os dois pontos da imagem sejam distinguidos: os detalhes deixam de ser resolvidos. De acordo com a teoria de Abbe , o limite de resolução (transversal) de um microscópio, ou seja, a menor distância abaixo da qual dois pontos vizinhos não serão mais distinguidos, pode ser expresso simplesmente usando o comprimento de onda de iluminação , o índice de refração na saída da objetiva e a metade ângulo do cone de luz máximo acessível . onde NA é o produto ou abertura numérica da lente. Podemos, portanto, aumentar a resolução de duas maneiras:
O limite de resolução de um microscópio óptico convencional é de aproximadamente 0,2 μm . O microscópio eletrônico de transmissão atingirá um limite 100 vezes menor. Resolução aprimorada em microscopia ópticaInúmeras técnicas de microscopia de luz permitem aumentar a resolução. Quando ultrapassam o limite de Abbe, são chamados de “super resolução” ou nanoscopias. Estes incluem, entre outros:
Usos e melhoriasMicroscopia de reflexãoQuando usamos um microscópio convencional, o usamos na transmissão, ou seja, a luz passa pela amostra observada. Também é possível trabalhar "em reflexão". Neste caso, a amostra é iluminada do mesmo lado que o observador, seja por cima para um microscópio vertical e por baixo no caso de microscópios invertidos usados em metalografia ou cristalografia. A luz produzida pela fonte passa pela objetiva pela primeira vez, chega na amostra, é refletida e passa novamente pela objetiva para observação, o que requer vários conjuntos de espelhos ou prismas. A microscopia de reflexão examina objetos opacos ou muito espessos para transmissão. Em troca, é claro, ele só pode fornecer informações na superfície da amostra no caso de observação em luz branca; na luz polarizada, permite revelar as orientações dos grãos dos constituintes dos minerais ou metais. Um caso clássico é a metalografia, onde fazemos observações de peças de metal chamadas metalografias desta forma. Como dito acima, o microscópio é frequentemente invertido, a parte a ser observada colocada na placa de suporte (geralmente perfurada com um orifício circular). Iluminação incidentalEm contraste com a iluminação diascópica ( dia - through), a luz episcópica ( epi - on) permite observar objetos de cor opaca e dar-lhes uma representação mais "natural". A ideia dessa iluminação é antiga, pois em 1740 , Descartes inspirou Lieberkühn que criou para suas observações ao microscópio um espelho de prata em torno da objetiva, o foco deste espelho direcionado ao preparo. Microscopia de campo claroA microscopia óptica de campo claro (ou “campo claro”) é a mais simples e mais antiga das técnicas de microscopia. Os comprimentos de onda usados (espectro visível) limitam o poder de resolução deste microscópio a 0,2 µm para aqueles que possuem a melhor óptica. A iluminação é por transmissão de luz branca, ou seja, a amostra é iluminada por baixo e observada de cima. As limitações desta técnica são principalmente um baixo contraste da maioria das amostras biológicas e uma baixa resolução devido ao embaçamento criado pelo material fora do plano focal. Por outro lado, a técnica é simples e a amostra requer apenas um preparo mínimo. Se a amostra for iluminada de cima, o microscópio é considerado um “microscópio invertido”. A objetiva é então localizada abaixo da preparação e o tubo da ocular endireita os feixes de luz para que as oculares fiquem “normalmente” posicionadas para o usuário. Microscopia de campo escuroO microscópio de campo escuro, que usa o princípio de "microscopia de campo escuro", melhora o contraste de amostras transparentes, mas não coradas. A iluminação de campo escuro usa uma fonte de luz cuidadosamente alinhada para minimizar a quantidade de luz transmitida diretamente e apenas coletar a luz espalhada pela amostra. Ele pode aumentar drasticamente o contraste, especialmente para amostras transparentes, enquanto requer pouco equipamento e preparação de amostra simples. No entanto, esta técnica sofre de baixa intensidade de luz coletada e ainda é afetada pelo limite de resolução. A iluminação Rheinberg é uma variante do campo escuro de iluminação em que filtros de cores transparentes são inseridos logo antes do condensador, de modo que os raios de luz mais ou menos oblíquos são coloridos de forma diferente (a parte inferior da imagem pode ser azul enquanto a amostra parece amarelo brilhante). O limite de resolução é o mesmo que em campo escuro. Outras combinações de cores são possíveis, mas sua eficácia é bastante variável. A microscopia de campo escuro é particularmente adequada para amostras frescas e permite a microcinematografia (por exemplo, de bactérias em movimento). Não tem interesse em objetos coloridos (manchas ou seções coloridas). É particularmente útil para:
Iluminação oblíquaO uso de iluminação oblíqua (lateral) dá uma imagem de aparência tridimensional e pode destacar aspectos invisíveis de outra forma. Essa é a principal vantagem. As limitações são as mesmas da microscopia de campo claro. Microscopia de luz polarizadaNa microscopia de luz polarizada, a amostra é colocada entre um polarizador e um analisador para detectar variações na polarização da luz após a passagem pela amostra. Esta técnica é muito útil para a observação de meios birrefringentes , em particular na mineralogia. Microscópio FluorescenteQuando certos compostos são iluminados por uma fonte de luz de alta energia, eles emitem luz com uma energia mais baixa. Este é o fenômeno da fluorescência . A microscopia de fluorescência (ou epifluorescência ) é uma técnica que usa um microscópio óptico equipado com um emissor de laser de radiação de fótons com um comprimento de onda preciso. Esta radiação excitará uma molécula alvo com propriedades fluorescentes. Permite aproveitar o fenómeno da fluorescência e da fosforescência , em vez ou em adição à clássica observação por Reflexão (física) ou absorção da luz visível natural ou artificial. Este método é de importância primordial hoje nas ciências da vida, graças, em particular, à marcação de estruturas celulares ou de tecidos com moléculas fluorescentes, como a rodamina ou a fluoresceína . Pode ser muito sensível, permitindo inclusive a detecção de moléculas isoladas. Diferentes estruturas ou compostos químicos também podem ser detectados simultaneamente usando diferentes compostos que serão diferenciados por sua cor de fluorescência. O microscópio de fluorescência de reflexão interna total ( TIRF , microscopia de fluorescência de reflexão interna total ), ou onda evanescente microscópica , é um tipo particular de microscópio óptico de fluorescência para examinar uma fatia muito fina de uma amostra (menos de 200 nm de espessura), graças a um determinado modo de iluminação: reflexão interna total . Microscópio de contraste de faseO contraste de fase é uma técnica amplamente usada que enfatiza as diferenças nos índices de refração como uma diferença no contraste. Foi desenvolvido pelo físico holandês Frederik Zernike na década de 1930 (ele recebeu o Prêmio Nobel por isso em 1953). O núcleo de uma célula, por exemplo, aparecerá escuro no citoplasma circundante. O contraste é excelente, porém esta técnica não pode ser usada com objetos grossos. Freqüentemente, um halo se forma em torno de pequenos objetos que podem abafar os detalhes. O sistema consiste em um anel circular no condensador que produz um cone de luz. Este cone é sobreposto a um anel de tamanho semelhante na lente. Cada objetiva possui um anel de tamanho diferente, por isso é necessário adaptar o condensador a cada mudança de objetiva. O anel na lente tem propriedades ópticas especiais: reduz a intensidade da luz direta e, mais importante, cria uma diferença de fase artificial de um quarto do comprimento de onda que cria interferência com a luz difusa e que cria o contraste da imagem. Microscópio de contraste de interferênciaO contraste de interferência (IC, IC para falantes de inglês) é uma técnica que permite que objetos transparentes sejam vistos aumentando seu contraste. Atualmente, é o IC segundo Nomarski, inventado na década de 1950, o mais difundido. Esta técnica proporciona um contraste mais importante em relação ao de fase ao eliminar o fenômeno do halo específico para este último. Ele se estabeleceu em microscopia em muitos campos hoje. Microscópio confocalO microscópio confocal gera uma imagem de uma maneira totalmente diferente da microscopia de campo claro normal. A resolução é um pouco melhor, mas o ponto mais importante é que permite formar uma imagem de seções transversais sem ser perturbado pela luz fora do plano focal. Portanto, dá uma imagem muito clara de objetos tridimensionais. O microscópio confocal é freqüentemente usado em conjunto com a microscopia de fluorescência. Microscópio invertidoMicroscópio sem lenteO microscópio sem lente registra o padrão de difração de um laser pela amostra (princípio da holografia ) e, em seguida, processa esse padrão por computador para gerar a imagem. Preparação de amostrasA amostra observada deve atender a certas condições:
Em biologia, primeiro é necessário colocar a seção de tecido (ou o líquido contendo organismos vivos) entre uma lâmina e uma lamela . A objetiva deve se aproximar da lâmina para focar sem, por falta de jeito, destruir o preparo que se tornou muito frágil. Devido à preparação, a microscopia óptica requer um grande número de dispositivos adicionais com o único propósito de observação microscópica. Tomemos o caso da biópsia na medicina e na biologia ( anatomopatologia ): o diagnóstico por microscopia, de partes biológicas colhidas por biópsia durante uma operação, impõe prazos curtos. Para o preparo da lâmina, utilizamos um aparelho denominado criotomo , uma espécie de "cortador de presunto", colocado em um criostato (freezer), que permite cortar fatias muito finas do corpo que serão observadas por resfriamento rápido, depois por corte usando a lâmina de uma navalha especial, afiada em outra máquina de placa de vidro com pastas de diamante. Se quisermos trabalhar em temperatura ambiente, os tempos são maiores e requerem desidratação e reposição da água retirada pela parafina (24 horas) para que a amostra mantenha sua rigidez; então, é colorido por várias substâncias de ação alternada de muito longa duração, também. Notas e referências
Veja tambémArtigos relacionados
links externos
Qual o equipamento capaz de ampliar imagens de objetos ou seres vivos?O microscópio é um instrumento óptico com capacidade de ampliar imagens de objetos muito pequenos graças ao seu poder de resolução. Este pode ser composto ou simples: microscópio composto tem duas ou mais lentes associadas; microscópio simples é constituído por apenas uma lente.
Qual equipamento é usado para ampliar a imagem de objetos ou seres muito pequenos?Os microscópios usam lentes convergentes para ampliar a imagem de objetos pequenos. Em virtude de sua capacidade de ampliar imagens, os microscópios são usados para observar objetos pequenos.
Como os microscópios ampliam a imagem dos objetos?A luz, que incide sobre um condensador, atravessa o objeto e é encaminhada para o canhão de lentes convergentes, formado pela objetiva e a ocular. Quando o feixe luminoso atinge a lente objetiva, forma-se uma imagem intermediária e aumentada do objeto.
Como se dá a ampliação total da imagem vista no microscópio?A ampliação total de um microscópio é o poder de ampliação individual da objetiva multiplicado pelo da ocular.
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