Quais as etapas para a preparação de células para serem observadas ao microscópio?

Processos utilizados na preparação de material para observação ao microscópio.
Na microscopia ótica podem-se utilizar dois tipos de preparações: as temporárias ou extemporâneas, usadas para a observação imediata do material, e as definitivas, preparações que podem ser guardadas e observadas várias vezes.
A preparação do material a observar ao microscópio engloba várias técnicas. Inicia-se com a colheita do material, que deve ocorrer em condições em que o objeto de estudo não seja danificado.
A fixação, inclusão, corte, coloração e montagem são algumas das técnicas utilizadas na preparação do material para observação em microscopia ótica.
Na microscopia eletrónica, são utilizadas técnicas de inclusão, corte, fixação e contraste para a preparação do material a observar.

A análise histopatológica consiste no estudo das células e tecidos do nosso corpo para realizar o diagnóstico de uma doença. A palavra histopatologia tem origem grega, sendo que “histo” significa tecido, “pathos” doença e “logia” estudo.

A histopatologia é uma área de estudo da anatomia patológica. A partir da análise microscópica é possível identificar alterações e anormalidades estruturais dos tecidos e células por meio do microscópio óptico, auxiliando no diagnóstico de neoplasias e anormalidades.

História da histopatologia

A técnica histológica representa um conjunto de procedimentos técnicos que, inicialmente, se difundiu entre os diversos profissionais das ciências naturais, como os botânicos e zoologistas, sendo empregada também pelos anatomistas e histologistas.

Os estudiosos utilizavam um microscópio simples para descrever os tecidos. Porém, somente duzentos anos após a descoberta do microscópio, a utilização da técnica histológica foi utilizada como ferramenta para diagnóstico histopatológico.

Por volta de 1828, Rudolph Virchow, médico alemão e antropologista, utilizou a análise histopatológica como ferramenta básica e essencial  para os laboratórios de histologia e/ou anatomia patológica, instituindo como bases para a patologia celular.

Microscópio – conheça as diversas técnicas de microscopia

Estudos dos tecidos e identificação das doenças

Para realizar o estudo da anatomia patológica é necessário ter uma amostra do material biológico, obtido através de biópsias e peças cirúrgicas.

Um órgão inteiro ou pequenos fragmentos são retirados do paciente para avaliar se as células apresentam alguma neoplasia e se são malignas ou benignas.

A maioria das doenças provoca modificações morfológicas nos órgãos e tecidos. O crescimento e maturação celular em seu estado normal são reconhecidos em padrões comuns.

Mas uma lesão pode provocar uma desordenação desse processo, resultando em perda de controle do crescimento, diferenciação e confinamento espacial das células. Muitas doenças apresentam anormalidades estruturais típicas, que diferem do estado natural da célula. O câncer, por exemplo, é caracterizado pelo crescimento anormal das células.

As técnicas histopatológicas permitem analisar a natureza dessas alterações celulares, sua apresentação clínica e evolução da doença, possibilitando o diagnóstico de inflamações, infecções e cânceres.

A importância da preservação da amostra

Entretanto, o desafio para a realização de qualquer exame anatomopatológico é a preservação dos tecidos. Existem várias etapas para o processamento de uma amostra que buscam preservar ao máximo a estrutura do tecido que será analisado depois.

Os tecidos precisam ser preparados para o estudo através da microscopia de luz. O exame ao microscópio é feito geralmente por luz transmitida, o que significa que a luz deve atravessar o objeto a ser examinado.

Assim, é necessária a obtenção de fragmentos dos tecidos que serão coletados, cortados em seções muito finas e transparentes, sendo depois corados para visualização.

As etapas para se obter a amostra de tecidos são: coleta do material, fixação, desidratação, clarificação, inclusão, microtomia (corte) e coloração.

Confira a seguir como é realizada a preparação de uma amostra para a investigação histopatológica.

Passo a passo: preparação do tecido para análise histopatológica

1. Coleta

É a primeira etapa e consiste na retirada de uma amostra de tecido para a investigação, chamadas de biópsias:

1. Biópsia cirúrgica: através de uma incisão cirúrgica no órgão ou tecido.
2. Biópsia endoscópica: para órgãos ocos, como estômago e intestino.
3. Biópsia por agulha: é obtida pela punção do órgão (fígado, pulmão), sem precisar abrir a cavidade natural.
4. Cirurgia ampla: corresponde a peças grandes (tumores) ou órgãos (mama e útero).
5. Necrópsia: pós morte para verificar a causa do óbito.

Essa amostra removida durante uma biópsia é chamada de espécime. Os cassetes histológicos são usados para acomodar esses espécimes e também durante todas as etapas de preparação do tecido.

2. Fixação

Ao se remover qualquer material (órgão ou tecido) de um organismo se inicia um processo de autólise (autodigestão). A fixação evita a autólise celular e impede a proliferação de microrganismos, preservando a morfologia do tecido e fornecendo maior resistência para as etapas seguintes.
Dessa forma, a fixação utiliza processos físicos ou químicos para imobilizar as substâncias constituintes das células e dos tecidos. Os agentes fixadores mais utilizados são o formol tamponado e o líquido de Bouin.

3. Desidratação

Consiste na remoção da água dos tecidos. Vários métodos são utilizados, porém o mais comum compreende uma série de soluções alcoólicas em concentrações diferentes, chegando até o álcool 100%.

4. Clarificação ou diafanização

Essa etapa remove totalmente o álcool, preparando o espécime para a etapa seguinte. Para remover o álcool e preparar o tecido para a penetração da parafina, utiliza-se o xilol. Conforme o xilol penetra o tecido, em substituição ao álcool, o material se torna mais claro, transparente. Por essa razão, é denominada de clarificação.

5. Inclusão

Mesmo após a fixação e a desidratação, as amostras de tecido são ainda muito frágeis. Acontece então a impregnação do tecido com uma substância de consistência firme. Assim o tecido é endurecido, o que facilita o corte em camadas finas.

A parafina é a mais utilizada neste procedimento. Além do fácil manuseio e bons resultados, endurece em poucos minutos e preenche os lugares anteriormente ocupados pela água. Forma-se um bloco de parafina, que contém o espécime em seu interior.

Os cassetes histológicos são utilizados durante todos os processos, até mesmo na inclusão. Eles permitem escrever o número de registro do material, identificando o espécime. Também são importantes para a microtomia, pois podem ser adaptados ao micrótomo.

6. Microtomia

Depois de endurecido, o bloco de parafina deve ser cortado em seções extremamente finas, que permitam a visualização do tecido ao microscópio. Para isso, é utilizado o equipamento de precisão micrótomo, que alcança a espessura dos cortes de 5 a 15 μm (micrômetros).

1 micrômetro (μm) é igual a 1/1.000 de 1 milímetro (mm). Assim, os cortes dos tecidos, extremamente finos e transparentes, são montados em lâminas de vidro.

7. Coloração

Como as seções de parafina são incolores, os espécimes não estão ainda adequados para exame com microscópio de luz. São então corados para possibilitar a análise.

A parafina deve ser dissolvida e removida. Em seguida os tecidos na lâmina são reidratados por meio de uma série de soluções de álcool em concentrações decrescentes.

Os cortes de tecido podem então ser corados com hematoxilina. Por sua natureza básica, a hematoxilina vai corar os ácidos nucleicos dos núcleos.

Em seguida, os cortes são lavados em e corados pela eosina, um corante de natureza ácida e que irá corar os componentes básicos predominantes no citoplasma das células.

Finalmente após a coloração, os cortes são protegidos por uma lamínula e podem ser analisados por microscopia.

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