Quais são os principais tipos de microscópios utilizadas para observação de células e organelas?

Postagem atualizada em 5 de abr, 2022 - 20:01h

Alguns microscópios oferecem maior resolução com ampliação menor e vice-versa, e seu custo varia de dezenas a milhares de reais; outros microscópios sequer geram imagens reais do objeto que estão observando! 

Então, para saber o tipo de microscópio para seu projeto, precisamos conhecer os as vantagens, desvantagens e aplicações ideais de cada equipamento.

Microscópios ópticos

O microscópio óptico, também conhecido como microscópio de luz, é um tipo de microscópio que usa luz visível e um sistema de lentes para gerar imagens ampliadas de pequenos objetos. Logo, podemos dizer que um microscópio óptico consiste nas seguintes duas funções básicas principais:

1. Criar uma imagem ampliada de uma amostra;
2. Iluminar uma amostra.

Para observar a amostra através de um microscópio óptico ela deve ser iluminada, e existem várias configurações de iluminação. Objetos transparentes podem ser iluminados por baixo e objetos sólidos podem ser iluminados com luz vindo através (campo claro) ou ao redor (campo escuro) da lente objetiva. 

A luz polarizada pode ser usada para determinar a orientação do cristal de objetos metálicos. A imagem de contraste de fase pode ser usada para aumentar o contraste da imagem, destacando pequenos detalhes de diferentes índices de refração.

Microscópio simples

O microscópio simples é geralmente considerado o primeiro microscópio inventado. Foi idealizado no século XVII por Antony van Leeuwenhoek, que combinou uma lente convexa com um suporte para observar espécimes.

Ampliando entre 200 e 300 vezes, o microscópio simples era essencialmente uma lupa. Embora este microscópio fosse simples, ainda era poderoso o suficiente para fornecer informações sobre espécimes biológicas, incluindo a diferença de formas entre os glóbulos vermelhos.

Hoje, microscópios simples não são usados com frequência graças a invenção do microscópio composto.

Microscópio composto

Com duas lentes, o microscópio composto oferece melhor ampliação do que um microscópio simples, já que a segunda lente amplia a imagem da primeira.

Os microscópios compostos são microscópios de campo claro e podem ser binoculares ou monoculares. Esses dispositivos fornecem uma ampliação de 1.000 vezes, considerada alta, embora a resolução destes microscópios seja baixa.

No entanto essa alta ampliação permite que os usuários observem de perto objetos pequenos demais para serem vistos a olho nu, incluindo células individuais. As amostras são geralmente pequenas e têm algum grau de transparência. 

Como os microscópios compostos são relativamente baratos e úteis, eles são usados em todos os lugares, desde laboratórios de pesquisa até salas de aula do ensino médio.

Microscópio estereoscópio

O microscópio estereoscópio, também chamado de microscópio de dissecação, fornece ampliação de até 300 vezes. Esses microscópios binoculares são usados para observar objetos opacos ou grandes demais para serem vistos com um microscópio composto, pois não requerem preparação de lâminas.

Embora sua ampliação seja relativamente baixa, eles ainda são úteis. Eles fornecem uma visão 3D das texturas da superfície dos objetos e permitem que o operador manipule o objeto durante a visualização. Isso é feito dando a cada olho sua própria perspectiva ou ângulo para dar a percepção da profundidade.

Os microscópios estéreo são usados em aplicações de ciências biológicas e médicas, bem como na indústria eletrônica, como por aqueles que fabricam placas de circuito ou relógios.

A desvantagem destes microscópios é que são necessários dois sistemas ópticos completos para gerar a imagem, tornando os estereoscópios mais complexos e caros. Também é muito difícil fazer estereoscópios com potência muito alta, pois os dois sistemas ópticos independentes competem por espaço próximo à lâmina da amostra. Microscópios de alta potência raramente são estereoscópicos.

Para imagens estéreo de alta potência, a amostra é frequentemente fotografada, depois movida levemente para uma segunda fotografia, e as duas imagens separadas são sobrepostas posteriormente.

Microscópio confocal

Ao contrário dos microscópios estéreo e compostos, que usam uma fonte de luz regular para a formação de imagens, o microscópio confocal usa uma luz de laser para digitalizar amostras que foram tingidas.

Essas amostras são preparadas em lâminas e inseridas; em seguida, com o auxílio de um espelho dicromático, o aparelho produz uma imagem ampliada na tela do computador. Os operadores também podem criar imagens 3D, montando várias digitalizações. Como o microscópio composto, esses microscópios oferecem um alto grau de ampliação, mas sua resolução é muito melhor. Eles são comumente usados em biologia celular e aplicações médicas.

Mas o mais extraordinário sobre este microscópio é que qualquer parte da amostra que estiver fora de foco ficará invisível. Portanto, o foco em qualquer foto obtida por microscopia confocal a laser será perfeito.

Além disso, embora na microscopia confocal de feixe de laser cada imagem represente um único plano de uma amostra que, na realidade, é tridimensional, se os diferentes planos que compõem a amostra forem retratados sucessivamente, o microscópio pode fazer uma reconstrução completa da amostra em suas três dimensões. Essa reconstrução tridimensional pode até ser girada para estudar a amostra de um ângulo diferente daquele de onde foi fotografada.

Microscópios eletrônicos

A microscopia eletrônica é uma técnica para obtenção de imagens de alta resolução de espécimes biológicos e não biológicos. É usado em pesquisas biomédicas para investigar a estrutura detalhada de tecidos, células, organelas e complexos macromoleculares. 

A alta resolução das imagens resulta do uso de elétrons (que possuem comprimentos de onda muito curtos) como fonte de radiação iluminante. A microscopia eletrônica é usada em conjunto com uma variedade de técnicas auxiliares (por exemplo, corte fino, marcação imunológica, coloração negativa).

Os microscópios eletrônicos surgiram como uma ferramenta poderosa para a caracterização de uma ampla gama de materiais. Sua versatilidade e resolução espacial extremamente alta os tornam uma ferramenta muito valiosa para muitas aplicações.

Microscópio eletrônico de varredura

O microscópio eletrônico de varredura (MEV) usa um feixe focado de elétrons de alta energia para gerar uma variedade de sinais na superfície de amostras sólidas. 

Os sinais que derivam das interações entre o elétron e a amostra revelam informações como a textura, composição química, estrutura cristalina e orientação dos materiais que compõem a amostra. 

Na maioria das aplicações, os dados são coletados em uma área selecionada da superfície da amostra e é gerada uma imagem bidimensional que exibe as variações espaciais dessas propriedades. Áreas que variam de aproximadamente 1 cm a 5 mícron de largura podem ser visualizadas em um modo de varredura usando técnicas convencionais de MEV (ampliação variando de 20x a aproximadamente 30.000x, resolução espacial de 50 a 100 nm). 

Indiscutivelmente, não há outro instrumento com a amplitude de aplicações no estudo de materiais que se compare ao MEV; a microscopia eletrônica de varredura é fundamental em todos os campos que requerem caracterização de materiais sólidos. A maioria dos MEVs são comparativamente fáceis de operar, com interfaces intuitivas e muitas aplicações requerem uma preparação mínima da amostra. Para muitas aplicações, a aquisição de dados é rápida.

Microscópio eletrônico de transmissão

Assim como o microscópio eletrônico de varredura, o microscópio eletrônico de transmissão (MET) usa elétrons na criação de uma imagem ampliada. As amostras também são digitalizadas no vácuo, de modo que devem ser especialmente preparadas. 

Ao contrário do MEV, no entanto, o MET usa uma preparação de lâminas especial para obter uma visão 2D das amostras, e por isso é mais adequado para visualizar objetos com algum grau de transparência. 

Um microscópio eletrônico de transmissão oferece um alto grau de ampliação e resolução, tornando-o útil nas ciências físicas e biológicas, metalurgia, nanotecnologia e análise forense.

Microscópio eletrônico de reflexão

O microscópio eletrônico de reflexão é uma combinação de técnicas de imagem, difração e espectroscopia para caracterização de topografia, estrutura cristalina e composição de superfícies de cristais únicos e envolve a detecção de um feixe de elétrons dispersos elasticamente que são refletidos na amostra que está sendo examinada.

As técnicas de difração de elétrons de alta energia por reflexão e espectroscopia de perda de alta energia por reflexão são frequentemente usadas neste tipo de microscopia.

Microscópio de raios X

Um microscópio de raios X usa a radiação eletromagnética na banda de raios X para produzir imagens ampliadas de objetos. Como os raios X penetram na maioria das amostras, não há necessidade de prepará-las para observações.

Ao contrário da luz visível, os raios X não refletem ou refratam facilmente e são invisíveis ao olho humano. Portanto, um microscópio de raios X expõe o filme ou usa um detector de dispositivo de carga acoplada (CCD) para detectar os raios X que passam pela amostra. 

É uma tecnologia de imagem de contraste que utiliza a diferença de absorção de raios X pelo átomo de carbono (elemento principal que compõe a célula viva) e o átomo de oxigênio (um elemento da água).

A microscopia de raios X tornou-se uma técnica rotineira usada em ciências ambientais e do solo, ciências de polímeros, biologia, magnetismo e ciências dos materiais. Com essa crescente demanda por microscopia de raios X nesses campos, microscópios baseados em sincrotron, ânodo de metal líquido e outras fontes de luz de laboratório estão sendo construídos em todo o mundo.

Outras tecnologias

Além da microscopia tradicional e eletrônica, métodos de microscopia que não utilizam luz ou elétrons têm sido desenvolvidos ao longo dos anos. Uma atenção especial vai para as técnicas de microscopia de varredura por sonda e microscopia acústica. 

Microscopia de varredura por sonda

A microscopia de varredura por sonda (MVS) é um ramo da microscopia que forma imagens de superfícies usando uma sonda física que varre a amostra. A MVS foi fundada em 1981, com a invenção do microscópio de tunelamento de varredura, um instrumento para imagens de superfícies em nível atômico.

Para formar imagens, os microscópios varrem uma ponta sobre a superfície da amostra. Em pontos discretos na varredura, é registrado um valor. Esses valores registrados são exibidos como um mapa de calor para produzir as imagens finais, geralmente usando uma escala de cores em preto e branco ou laranja.

A resolução dos microscópios de varredura por sonda não é limitada pela difração, apenas pelo tamanho do volume de interação sonda-amostra, que pode ser tão pequeno quanto alguns picômetros. Portanto, a capacidade de medir pequenas diferenças locais na altura do objeto é incomparável. Ainda assim, a forma detalhada pode ser difícil de determinar. Seu efeito sobre os dados resultantes é particularmente perceptível se a altura da amostra variar muito, por exemplo.

As técnicas de digitalização são geralmente mais lentas na aquisição de imagens, devido ao processo de digitalização. Como resultado, esforços estão sendo feitos para melhorar a taxa de varredura. 

Como todas as técnicas de varredura, a incorporação de informações espaciais em uma sequência de tempo abre a porta para incertezas na metrologia, que surgem devido a efeitos no domínio do tempo, como deriva de amostras, oscilação de feedback e vibração mecânica.

Microscopia acústica

A microscopia acústica utiliza microscópios que empregam ultrassom de frequência muito alta ou ultra-alta. Eles operam de forma não destrutiva e penetram na maioria dos materiais sólidos para fazer imagens visíveis de características internas, incluindo defeitos como rachaduras, delaminações e vazios.

Um transdutor ultrassônico varre a superfície superior da amostra, onde milhares de pulsos entram na amostra a cada segundo. Cada pulso pode ser espalhado ou absorvido ao passar por partes homogêneas da amostra, nas interfaces de materiais, uma parte do pulso é refletida de volta ao transdutor, onde é recebida e sua amplitude registrada.

Se ambos os materiais forem sólidos típicos, o grau de reflexão será moderado e uma porção significativa do pulso viajará mais profundamente na amostra, onde poderá ser parcialmente refletida por interfaces de material mais profundas.

Devido à sua capacidade de caracterizar uma amostra de forma não destrutiva, os microscópios acústicos são amplamente utilizados na produção de componentes eletrônicos e montagens para controle de qualidade, confiabilidade e análise de falhas. 

Normalmente o interesse está em encontrar e analisar defeitos internos, embora um microscópio acústico também possa ser usado simplesmente para verificar que uma determinada peça ou determinado material atende às especificações.

Considere-se sortudo se você teve a oportunidade de usar cada um desses diferentes microscópios. Alguns deles, como os microscópios eletrônicos, são tão caros que você só os encontrará em universidades ou laboratórios especializados. 

O mundo da microscopia está crescendo a cada dia, e quanto mais avanços tecnológicos forem feitos no campo, mais o micromundo será revelado. 

Referências

Hsu, T., Cowley, J. M., Peng, L.-M., & Ou, H.-J. (1987). Reflection electron microscopy methods for the study of surface structure. Journal of Microscopy, 146(1), 17–27. doi:10.1111/j.1365-2818.1987.tb01323.x 

O'Toole, Kevin; Esser, Bob; Binfield, Seth; Hillman, Craig; Beers, Joe (2009). "Pb-Free Reflow, PCB Degradation, and the Influence of Moisture Absorption" (PDF). APEX.

https://www.hitachi-hightech.com/global/science/technical/tech/microscopes/spm/descriptions/mechanical/ffm.htm